Microdevice-integrated immunoassays for point-of-care therapeutic drug monitoring

Bojescu, Elena-Diana (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Lausanne, Suisse)

A significant number of drugs such as antibiotics, immunosuppressants or antiepileptics exhibit narrow therapeutic windows and high inter-individual pharmacokinetic variability. In such cases, Therapeutic Drug Monitoring (TDM) is compulsory in order to optimize the efficacy of the drug while avoiding adverse effects. Concentration measurements required for doseadjustments are however complex and are therefore only performed at specialized facilities. The development of a device for accurate whole-blood quantification of critical drugs at the Point-of-Care (POC) would enable fast time-to-result and provide a more convenient solution to patients. This thesis aimed at the design of sample-to-result devices comprising microstructures that allowed for the quantification of small molecules in blood. The designs were based on the development and use of miniaturized fluorescence polarization immunoassays (FPIA). The main feature offered by the FP assay format was the ability to perform homogeneous measurements with no separation or washing steps required, making it particularly suitable for automation. An important result of this thesis is the demonstration that the concentration of small drugs can be quantified in whole blood within paper-like membranes using Fluorescence Polarization Immunoassay (FPIA). Different types of paper-like materials such as glass microfibers, cellulose and filter paper were screened for artefacts such as scattering or autofluorescence. Accurate determination of the fluorescence polarization of red-emitting fluorophores at subnanomolar concentrations was found possible within glass fiber membranes. This enabled the development of a competitive immunoassay for the quantification of the antibiotic tobramycin using only 1 µL of plasma in glass fiber micro-chambers. Furthermore, the same membrane was used for transversal separation of blood cells followed by accurate FPIA read-out at the bottom part of the micro-chamber. Within the therapeutic window, coefficients of variation were around 20% and recoveries between 80-105%, demonstrating the ability to run quantitatively both clinical chemistry and sample preparation by incorporating FPIA in glass fiber membranes. Another important step towards a POC device was the design of a compact, bench-top FPbased analyzer. In this case, glass capillaries were used as detection chambers as they cause little light scattering and for reasons of convenience. Once assembled, the performance and functionality (i.e. ease of alignment of the optical parts, sensitivity) of the analyzer were assessed by measuring total fluorescence intensity as well as anisotropy of the prototypical fluorescent dye fluorescein. Furthermore, the new optical system was employed for tobramycin quantification previously spiked in plasma samples showing good analytical performance in terms of coefficients of variation and recoveries within the therapeutic range of the drug. A more challenging class of drugs are the immunosuppressants, administered in cases of organ transplantation. For tacrolimus, for instance, due to its distribution within red blood cells an dits very low concentration, an assay can become laborious in terms of sample preparation and implementation into microstructures. Here, several fluorescent derivatives of tacrolimus at different wavelengths were synthetized. Their affinity for various biorecognition molecules were tested allowing the choice of a ligand-receptor pair for the development of a FPIA for tacrolimus quantification in buffer. Next, attempts were undertaken to adapt the immunoassay for analysis in whole blood samples. Considerable challenges due to the complexity of the matrix were revealed and initiated efforts to improve the blood preparation techniques with the aim of quantifying tarcolimus within its therapeutic range. With the aim of paving the way towards personalized therapies, this thesis makes the realisation of a POC for TDM a realistic goal.

Un significante numero di farmaci come gli antibiotici, gli immunosoppressori o gli antiepilettici, presentano una stretta finestra terapeutica e gradi variazioni farmacocinetiche inter-individuali. In questi casi, il monitoraggio dei farmaci terapeutici è necessario per l’ottimizzazione dell’efficienza del farmaco e nello stesso tempo per evitare gli effetti avversi. Le misure di concentrazione necessarie per l’adattamento delle dosi sono comunque complesse e di conseguenza sono eseguite nelle strutture specializzate. Lo sviluppo di un dispositivo portatile e prossimo al paziente, per l’accurata quantificazione dei farmaci critici consentirebbe un risultato veloce e una soluzione più conveniente per gli pazienti. L’obiettivo della tesi è stato il design di piattaforme analitiche con microstrutture incorporati, che hanno permesso la quantificazione di piccole molecole in sangue. Lo sviluppo di queste piattaforme è stato possibile con l’utilizzo di metodi miniaturizzati basati sulla fluorescenza polarizzata (FPIA). La caratteristica principale offerta da questo formato FP è stata l’abilità di eseguire misure omogenei, facendo questa tecnica particolarmente adatta per l’automatizzazione. La tesi ha dimostrato che la concentrazione dei farmaci di basso peso molecolare può essere quantificata in sangue dentro le membrane di carta utilizzando il metodo di Fluorescenza Polarizzata. Diversi tipi di carta e microstrutture simili come per esempio le, cellulosi e carta da filtro sono stati analizzati in quanto riguarda la dispersione della luce ma anche l’autofluorescenza. Questo ha permesso lo sviluppo di un metodo competitivo per la quantificazione dell’antibiotico tobramicina, usando soltanto 1 µl di plasma nelle microfibre di vetro. Inoltre, le stesse membrane sono state utilizzate per la separazione trasversale del sangue competo, seguito da lettura accurata della fluorescenza polarizzata nella parte inferiore della micro-camera di misura. Nella finestra terapeutica, i coefficienti di variazioni sono stati intorno a 20% e la concentrazione ricoverata tra 80-105%, dimostrando l’abilità di eseguire quantitativamente chimica clinica e preparazione del campione tramite l’incorporamento della Fluorescenza Polarizzata dentro le microfibre in vetro. Un significante passo verso un dispositivo POC è stato il design e sviluppo di un dispositivo analitico miniaturizzato e compatto basato sulla fluorescenza polarizzata. In questo caso, i capillari di vetro sono stati utilizzati come contenitori di misura per via della loro bassa dispersione della luce e motivi di convenienza. Una volta assemblato, la funzionalità, è stata valutata misurando l’intensità di fluorescenza totale cosi come l’anisotropia della molecola fluorescente prototipo, fluoresceina. Inoltre, il nuovo sistema ottico, utilizzato per la quantificazione della tobramicina, in precedenza aggiunta in campioni di plasma, mostra buona caratteristica analitica in termini di coefficienti di variazioni entro la finestra terapeutica del farmaco. Una classa di farmaci più esigenti sono gli immunosoppressori, somministrati in casi si trapianto di organi. Per tacrolimus, a causa della sua distribuzione nelle cellule rosse e la sua concentrazione molto bassa, un metodo per la sua quantificazione può diventare laboriosa in termini di preparazione del campione e implementazione nelle microstrutture. Qui, diversi derivativi fluorescenti a diverse lunghezze d’onda sono stati sintetizzati. La loro affinità verso varie molecole biocompatibili è stata testata permettendo la scelta della coppia ligandorecettore adatta per lo sviluppo di FP per la quantificazione di tacrolimus in buffer. In seguito, tentativi sono stato fatti per adattare il test per l’analisi del farmaco in sangue. Con lo scopo di aprire la strada verso le terapie personalizzate, questa tesi prevede che la realizzazione di una piattaforma analitica miniaturizzata per il monitoraggio dei farmaci è un obiettivo realistico.


Note: Thèse no 8226 (2018) présentée le 4 mai 2018 à la Faculté des sciences et techniques de l'ingénieur, chaire Swiss-up en ingénierie - Laboratoire d'électronique pour les sciences du vivant, programme doctoral en chimie et génie chimique. Parole chiave: monitoraggio terapeutico dei farmaci; dispositivo point-of-care; sistemi microfluidici, carta, tobramicina, tacrolimus, Fluorescenza Polarizzata


Keywords:
Faculty:
Ingénierie et Architecture
School:
HEI-VS
Institute:
Institut Technologies du vivant
Subject(s):
Ingénierie
Publisher:
Lausanne, EPFL
Date:
2018-05
Lausanne
EPFL
Pagination:
107 p.
Advisor:
Prof. Guiducci, Carlotta., Prof Segura, Jean-Manuel
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 Record created 2018-12-11, last modified 2018-12-11

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